ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

или технология рекомбинантных ДНК, изменение с помощью биохимических и генетических методик хромосомного материала - основного наследственного вещества клеток. Хромосомный материал состоит из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Биологи изолируют те или иные участки ДНК, соединяют их в новых комбинациях и переносят из одной клетки в другую. В результате удается осуществить такие изменения генома, которые естественным путем вряд ли могли бы возникнуть. Методом генной инженерии получен уже ряд препаратов, в том числе инсулин человека и противовирусный препарат интерферон. И хотя эта технология еще только разрабатывается, она сулит достижение огромных успехов и в медицине, и в сельском хозяйстве. В медицине, например, это весьма перспективный путь создания и производства вакцин. В сельском хозяйстве с помощью рекомбинантной ДНК могут быть получены сорта культурных растений, устойчивые к засухе, холоду, болезням, насекомым-вредителям и гербицидам.
Перенос плазмид у бактерий. Большая часть работ по переносу участков ДНК, или генов, проводилась до последнего времени на бактериях. У бактерий генетическая информация заключена в одной большой молекуле ДНК - хромосоме бактерии. Поскольку бактерии размножаются бесполым путем, эта генетическая информация на протяжении многих поколений остается в значительной степени неизменной. В бактериальной клетке имеются, помимо главной ее хромосомы, еще и небольшие кольцевые сегменты ДНК. Эти молекулы ДНК, т.н. плазмиды, часто несут в себе гены, ответственные за устойчивость к антибиотикам. Плазмиды можно извлечь из одной клетки и перенести в другую. Такие работы проводятся, например, на Esсherichia coli (кишечной палочке), безвредной бактерии, обитающей в желудочно-кишечном тракте человека. Некоторые из клеток E. coli содержат плазмиду с генами устойчивости к антибиотику тетрациклину. Такие плазмиды - их называют факторами устойчивости - легко отделить от главной хромосомной ДНК. Неустойчивые к тетрациклину (разрушаемые им) бактерии можно заставить включить в себя эти плазмиды, подвергнув клетки соответствующей химической обработке, которая сделает оболочку проницаемой для чужих плазмид. Клетки, получившие таким способом фактор устойчивости, выживают на культуральной среде, содержащей тетрациклин, тогда как неустойчивые клетки погибают. Из каждой клетки - в результате многократных делений - возникает клон, т.е. собрание точных копий одной-единственной клетки, полученных путем бесполого размножения. Плазмида воспроизводится в каждой клетке клона, и ее воспроизведение называют молекулярным клонированием. Соединение разных плазмид. Плазмиды можно разрезать, фрагменты сращивать друг с другом, а затем такие комбинированные плазмиды вводить в клетки. Можно соединять фрагменты ДНК одного и того же вида или же разных видов. Поскольку плазмидная ДНК представляет собой замкнутую кольцевую молекулу, кольцо нужно сперва разорвать таким образом, чтобы свободные концы были в химическом отношении реакционноспособными, пригодными для последующего соединения. Достичь этого удается либо простым механическим путем (например, сильным встряхиванием), либо с помощью различных ферментов, называемых нуклеазами (рестриктазами). Затем фрагменты ДНК соединяют с помощью лигаз - ферментов, исправляющих повреждения в ДНК и сшивающих концы ее разорванных нитей. Именно таким путем плазмиды из штамма E. coli, устойчивого к тетрациклину, и плазмиды из штамма, устойчивого к другому антибиотику, каномицину, можно соединить и получить штамм E. coli, устойчивый к обоим антибиотикам.
Эксперименты с двумя видами. Плазмиды другого вида бактерий, например Staphylococcus aureus (золотистого стафилококка), сами по себе не способны размножаться в клетках E. coli. Однако в них могут размножаться гибридные плазмиды, составленные искусственным путем из куска плазмиды S. aureus и фрагмента плазмиды E. coli. Был проведен эксперимент, в котором соединили плазмиды S. aureus, устойчивого к пенициллину, и плазмиды штамма E. coli, устойчивого к тетрациклину. Когда затем гибридные плазмиды были введены в клетки E. coli, полученный штамм оказался устойчивым и к пенициллину, и к тетрациклину. Этот эксперимент, в котором был осуществлен перенос генетической информации между неродственными организмами, позволил предположить, что в клетки бактерии можно вводить молекулы ДНК и высших организмов и что они будут в этих клетках реплицироваться (копироваться).
Перенос генов животных. Из генов животных первыми были введены в бактерию гены шпорцевой лягушки Xenopus laevis. Эти гены хорошо изучены и легко поддаются идентификации. Их ввели в клетки штамма E. coli, устойчивого к тетрациклину, и они здесь реплицировались. У полученных клонов состав ДНК соединял в себе характеристики X. laevis и E. coli. В настоящее время научились уже переносить гены от одного животного к другому и от животного к растениям. Получены "трансгенные" мыши, свиньи, овцы, коровы и рыбы. ДНК можно прямо инъецировать в оплодотворенное яйцо вида-реципиента, или можно использовать в качестве переносчика вирус, который, проникнув в клетку, внесет с собой и нужный ген. Третий метод связан с использованием неспециализированных стволовых (т.е. родоначальных) клеток эмбриона. Гены вводят в стволовые клетки путем инъекции или с помощью вируса, и полученные в результате трансгенные клетки инъецируют другому зародышу, который включает эти чужие клетки в свои ткани. Гены человека вводили и в растения, например в табак, в надежде получить таким способом большие количества нужных белков, в частности антител и ферментов. В этих экспериментах перенос генов оказался довольно простым делом. Была придумана специальная "генная пушка", выстреливающая ДНК прямо в листья растений.
Практическое применение. Теперь умеют уже синтезировать гены, и с помощью таких синтезированных генов, введенных в бактерии, получают ряд веществ, в частности гормоны и интерферон. Их производство составило важную отрасль биотехнологии. Интерферон - белок, синтезируемый организмом в ответ на вирусную инфекцию, изучают сейчас как возможное средство лечения рака и СПИДа. Понадобились бы тысячи литров крови человека, чтобы получить такое количество интерферона, какое дает всего один литр бактериальной культуры. Ясно, что выигрыш от массового производства этого вещества очень велик. Очень важную роль играет также получаемый на основе микробиологического синтеза инсулин, необходимый для лечения диабета. Методами генной инженерии удалось создать и ряд вакцин, которые испытываются сейчас для проверки их эффективности против вызывающего СПИД вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). С помощью рекомбинантной ДНК получают в достаточных количествах и человеческий гормон роста, единственное средство лечения редкой детской болезни - гипофизарной карликовости. Еще одно перспективное направление в медицине, связанное с рекомбинантной ДНК, - т.н. генная терапия. В этих работах, которые пока еще не вышли из экспериментальной стадии, в организм для борьбы с опухолью вводится сконструированная по методу генной инженерии копия гена, кодирующего мощный противоопухолевый фермент. Генную терапию начали применять также для борьбы с наследственными нарушениями в иммунной системе. В сельском хозяйстве удалось генетически изменить десятки продовольственных и кормовых культур. В животноводстве использование гормона роста, полученного биотехнологическим путем, позволило повысить удои молока; с помощью генетически измененного вируса создана вакцина против герпеса у свиней.
Общественное мнение. Несмотря на явную пользу от генетических исследований и экспериментов, само понятие "генная инженерия" породило различные подозрения и страхи, стало предметом озабоченности и даже политических споров. Многие опасаются, например, что какой-нибудь вирус, вызывающий рак у человека, будет введен в бактерию, обычно живущую в теле или на коже человека, и тогда эта бактерия будет вызывать рак. Возможно также, что плазмиду, несущую ген устойчивости к лекарственным препаратам, введут в пневмококк, в результате чего пневмококк станет устойчивым к антибиотикам и пневмония не будет поддаваться лечению. Такого рода опасности, несомненно, существуют. Генетические исследования ведутся серьезными и ответственными учеными, а методы, позволяющие свести к минимуму возможность случайного распространения потенциально опасных микробов, все время совершенствуются. Оценивая возможные опасности, которые эти исследования в себе таят, следует сопоставлять их с подлинными трагедиями, вызванными недоеданием и болезнями, губящими и калечащими людей.
См. также

генная инженерия

генная инженерия иначе генетическая инженерия (англ. gene engineering или genetic engineering) — совокупность приемов, методов и технологий выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами (в том числе получения рекомбинантных РНК и ДНК) и введения их в другие организмы.

Описание

Генная инженерия является инструментом биотехнологии. В ней используются методы молекулярной и клеточной биологии, цитологии, генетики, микробиологии и вирусологии. Генная инженерия применяется для получения желаемых качеств изменяемого (генетически модифицированного) организма. В отличие от традиционной селекции, в ходе которой организм подвергается изменениям собственного генома посредством мутаций, методы генной инженерии позволяют изменять геном посредством введения в него желаемых генов, в том числе совершенно чужеродных. Примерами применения генной инженерии являются: получение генетически модифицированных сортов культурных растений, обладающих новыми полезными свойствами; создание бактерий и грибов, продуцирующих гормоны, антибиотики, витамины, ферменты и других вещества для нужд фармацевтической и пищевой промышленности; создание трансгенных животных в качестве живых фабрик для производства биомедицинских препаратов, а также новых пород экспериментальных мышей (нокауты) для научных исследований функционирования определенных генов.

В области нанобиотехнологий — создание генно-инженерных химерныхбелков, ионных каналов и биологических моторов с принципиально новыми свойствами ложится в основу современных биосенсоров, систем доставки лекарств и т.п.

НАИБОЛЕЕ ВПЕЧАТЛЯЮЩИЕ ПРАКТИЧЕСКИЕ СВЕРШЕНИЯ

Среди многих достижений генной инженерии, получивших применение в медицине, наиболее значительное W получение человеческого инсулина в промышленных масштабах.

Всем широко и печально известна такая болезнь, как сахарный диабет, когда организм человека утрачивает способность вырабатывать физиологически важный гормон W инсулин. В результате в крови накапливается сахар и больной может погибнуть. Инсулин уже давно получают из органов животных и используют в медицинской практике. Однако многолетнее применение животного инсулина ведет к необратимому поражению многих органов пациента из-за иммунологических реакций, вызываемых инъекцией чужеродного человеческому организму животного инсулина. Но даже потребности в животном инсулине до недавнего времени удовлетворялись всего на 60 - 70%. Так, в 1979 году из 6 млн. больных во всем мире только 4 млн. получали инсулин. Без лечения инсулином больные умирали. А если учесть, что среди больных диабетом немало детей, становится понятным, что для многих стран это заболевание превращается в национальную трагедию.

Генные инженеры в качестве первой практической задачи решили клонировать ген инсулина. Клонированные гены человеческого инсулина были введены с плазмидой в бактериальную клетку, где начался синтез гормона, который природные микробные штаммы никогда не синтезировали. Начиная с 1982 года фирмы США, Японии, Великобритании и других стран производят генно-инженерный инсулин. Проблема решена. Из 1000 литров бактериальной культуры получают приблизительно 200 г инсулина, что равно количеству, получаемому из 1600 кг поджелудочной железы животных. Параллельно была решена проблема иммунологического поражения организмов диабетиков животным инсулином.

Производство и продажу инсулина впервые начала американская фирма Eli Lilly. Мировой рынок инсулина составляет в настоящее время более 400 млн. долларов, ежегодное потребление около 2500 кг.

Более двадцати фирм Японии и несколько американских фирм разрабатывали другой очень важный медицинский препарат W интерферон, который эффективен при различных вирусных заболеваниях и злокачественных новообразованиях. Первым из этих соединений на рынок поступил альфаинтерферон, затем бета-интерферон.

Еще один эффективный противораковый препарат W интерлейкин W производится в Японии и США. Интересно отметить, что сегодня американский рынок медицинских препаратов, полученных методами генной инженерии, сравним с такими массовыми лекарствами, как антибиотики. К 2000 году стоимость продукции, выпускаемой в США на основе генно-инженерных методов, достигнет 50 млрд. долларов в год.

Около 200 новых диагностических препаратов уже введены в медицинскую практику, и более 100 генно-инженерных лекарственных веществ находится на стадии клинического изучения. Среди них лекарства, излечивающие артрозы, сердечно-сосудистые заболевания, некоторые опухолевые процессы и, возможно, даже СПИД. Среди нескольких сотен генно-инженерных фирм 60% работают над производством лекарственных и диагностических препаратов.

Генотерапия

Неблагоприятная экологическая обстановка и целый ряд других подобных причин приводят к тому, что все больше детей рождается с серьезными наследственными дефектами. В настоящее время известно 4000 наследственных заболеваний, для большинства из которых не найдено эффективных способов лечения.

Генные инженеры уже внесли свой вклад в решение этой проблемы, разработав диагностические препараты, позволяющие обнаруживать генетические аномалии в период беременности, что дает возможность предотвратить рождение больного ребенка. Однако более одного процента всех новорожденных имеют генетические заболевания, которые приводят к физическим и умственным нарушениям, а также к ранней смерти.

Буквально с первых шагов генной инженерии ученые задались целью разработать методы исправления генетических повреждений путем введения в организм "здоровых" генов. В 1989 году в Национальных Институтах Здоровья США впервые была предпринята попытка применить в клинической практике генотерапию для лечения опасного заболевания "тяжелый комбинированный иммунодефицит" (ТКИД). В настоящее время генотерапия ТКИД проходит завершающую стадию клинических испытаний.

Наиболее обнадеживающие результаты ожидают в тех случаях, когда заболевание обусловлено дефектом одного гена. В этом случае полагают, что удастся вводить нормальный ген в соматические клетки прицельно в то место на хромосоме, где находится дефектный ген. При гомологичной рекомбинации введенный ген заместит дефектный. Такой однократной процедуры в ряде случаев будет достаточно, чтобы излечить болезнь. Однако на практике очень трудно проконтролировать судьбу введенной в клетки ДНК, и на одно правильное встраивание в генном приходится более 1000 случайных. Разрабатывается и другой подход, когда введенный ген не заменяет дефектный, а компенсирует его функцию, встраиваясь в хромосому в другом месте.

Исследования ведутся очень интенсивно, хотя до реализации программы лечения для большинства наследственных заболеваний предстоит еще длинный и многотрудный путь. Возможность излечения таких заболеваний путем введения нормальных генов W это такая благородная задача, что в некоторых странах исследования в области генотерапии считаются наиболее приоритетными и финансируются в первую очередь.

Трансгенные растения

Веками селекционеры работают над выведением новых сортов культурных растений, придавая им свойства, необходимые для практического использования. Достаточно сравнить цветок розы с цветком шиповника, чтобы убедиться, сколь велики достижения трудов человеческих. Правда, при этом вспоминаешь, что путь от диких предков к культурным растениям простирается на десятки тысяч лет. При этом чем лучше сорт растения или порода животного, тем они капризнее, больше подвержены различным вирусным и микробным заболеваниям, малоустойчивы к насекомым, засухе и т.д.

И вот генные инженеры решили помочь селекционерам сделать культурные растения такими же устойчивыми к болезням и различным экстремальным воздействиям, как и их дикие предки.

С этой целью была разработана система переноса в растения различных чужих генов, которые могут сообщать растениям полезные свойства. Наиболее распространен перенос генов с помощью вируса, поражающего фитопатогенную бактерию Agrobacterium tumefaciens. Плазмида найденного в клетках A. tumefaciens способна переносить часть своей ДНК в растительные клетки. Именно в эту ДНК встраивается необходимый "полезный" ген. Растения, в хромосому которых встраивается чужой ген, называются трансгенными.

Впервые трансгенные растения были получены в 1982 году учеными из Института растениеводства в Кельне и компании Monsanto. В результате растения приобрели устойчивость к антибиотику канамицину, ингибирующему рост. В настоящее время только в компании Monsanto получено более 45 тысяч независимых линий трансгенных растений.

Одна из важных задач - получение растений, устойчивых к вирусам, так как в настоящее время не существует прямых способов борьбы с вирусными инфекциями сельскохозяйственных культур. Ученые из Университета штата Вашингтон решили, что устойчивость к вирусам можно "привить" растениям, вводя в растительные клетки гены белка оболочки вируса табачной мозаики. Эксперимент полностью подтвердил это предположение: интенсивный синтез белка оболочки любого вируса в клетках растений вызывает устойчивость к данному вирусу. В настоящее время получены трансгенные растения, способные противостоять воздействию более десятка различных вирусных инфекций. Еще одна задача связана с защитой растений от насекомых-вредителей. Применение инсектицидов не вполне эффективно, во-первых, из-за их токсичности, во-вторых, потому, что дождевой водой они смываются с растений. В генно-инженерных лабораториях Бельгии и США были успешно проведены работы по внедрению в растительную клетку генов, отвечающих за синтез инсектицидов бактериального происхождения. Эти гены ввели в клетки картофеля, томатов и хлопчатника. Трансгенные растения картофеля и томатов были устойчивы к колорадскому жуку, растения хлопчатника оказались устойчивыми к разным насекомым, в том числе к хлопковой совке. Применение инсектицидов было сокращено на 40 - 60%.

Генные инженеры вывели трансгенные растения с удлиненным сроком созревания плодов. Такие помидоры, например, можно снимать с куста красными, не боясь, что они перезреют при транспортировке.

Список растений, к которым успешно применены методы генной инженерии, составляет около пятидесяти видов, включая яблоню, сливу, виноград, капусту, баклажаны, огурец, пшеницу, сою, рис, рожь и много других сельскохозяйственных растений, возделывание которых в ближайшем будущем будет существенно облегчено благодаря генетическим модификациям.

На рис. 3 показаны два метода создания трансгенных растений. При использовании Agrobacterium вводимая ДНК (чужеродный ген) включается в бактериальную плазмиду. Бактериями, несущими химерную плазмиду, заражают клетки растений и переносят в них нужную ДНК. Второй метод W так называемая ДНК-пушка W состоит в том, что растительные клетки бомбардируют металлическими частицами, покрытыми ДНК. В обоих случаях попавшая в клетку ДНК встраивается в ее хромосомы, затем клетка делится, и из нее регенерирует целое растение.

НЕКОТОРЫЕ НАУЧНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Уже первые шаги в области изучения рекомбинантных молекул позволили считать, что достигнут не просто успех, но осуществлен прорыв, открывающий новые пути для познания наследственности. Возникли исключительные условия для изучения механизмов функционирования и структурной организации генома, в том числе и генома человека. Используя методы генной инженерии, ученые сделали много поразительных открытий. К одному из них относится явление дискретности генов эукариот. Если раньше было признано положение о коллинеарном переносе генетической информации от ДНК на мРНК и от мРНК на блок, то сейчас установлено, что гены животных и растений имеют внутри такие последовательности, которые после транскрипции удаляются и не копируются в структуре белка. Значимые части гена назвали экзонами, а удаляемые части W интронами. Последовательности РНК, соответствующие интронам, вырезаются и не транслируются, а последовательности, соответствующие экзонам, сшиваются специальными ферментами. Процесс получил название сплайсинг (рис. 2).

Другое очень важное открытие состоит в следующем. Было известно, что у бактерий, да и не только у них, в составе генома имеются такие гены, которые перемещаются, мигрируют, меняют свое место на хромосоме. Генная инженерия позволила глубже проникнуть в природу подвижных элементов, изучить их структуру, механизмы действия и биологическую роль. Именно при перемещении подвижных элементов (транспозонов) и происходит часто негомологичная рекомбинация.

ЧЕМ ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ПРИНЦИПИАЛЬНО ОТЛИЧАЕТСЯ ОТ КЛАССИЧЕСКОЙ СЕЛЕКЦИИ?

Для того чтобы это понять, перечислим ограничения, с которыми сталкиваются селекционеры при получении новых пород животных, сортов растений или активных рас практически ценных микроорганизмов:

1) нельзя скрещивать неродственные виды;

2) нельзя извне управлять процессом рекомбинации в организме;

3) нельзя предугадать, какое получится потомство.

Известно, что в природе скрещиваются между собой только близкородственные организмы, так как существуют специальные клеточные барьеры скрещивания клеток. Кроме того, процесс рекомбинации заключается во взаимодействии между гомологичными, то есть близкими по своей молекулярной структуре, хромосомами. Постоянство своего генетического состава организм очень надежно охраняет. Даже самая богатая фантазия не может вообразить, каких монстров породила бы природа, если бы не охраняла чистоту вида, препятствуя скрещиванию неродственных форм.

Генетическая рекомбинация в организме W очень сложный процесс, которым управлять извне невозможно. Это обстоятельство делает путь к получению новой породы или расы очень тернистым, долгим, а подчас и невозможным.

Результаты скрещивания невозможно предсказать заранее. Как хочется, чтобы ребенок был таким же очаровательным, как мама, сильным и добрым, как папа, умным, как дедушка, и веселым, как бабушка. Но процесс рекомбинации - статистический, и нам не дано стопроцентно предугадать, какие признаки родителей унаследует потомство, и результат бывает иногда прямо противоположным ожидаемому.

Молекулярная биология вооружила ученых пониманием законов передачи от родителей потомству наследственной информации. Стали понятными причины ограничений классической селекции, а также то обстоятельство, что природные механизмы, стоящие на страже чистоты и стабильности своего генома, преодолеть практически невозможно.

А что если попытаться проводить рекомбинацию хромосом или отдельных генов вне организма (in vitro), в пробирке? Первые удачные эксперименты такого рода сделаны в 1972 году, и вскоре был создан арсенал приемов и методов, позволяющих производить рекомбинацию генов in vitro, затем вводить полученную генную конструкцию в клетку, при этом в последней синтезируются продукты введенных генов.

Таким образом, суть генной инженерии состоит в том, что процесс рекомбинации производится вне организма и таким образом преодолеваются все ограничения, с которыми сталкиваются ученые, используя приемы классической селекции. Итак, теперь все стало можно: можно скрещивать отдельные гены "ужа и ежа", можно управлять процессом, можно предсказать результат

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

И. Б. ЛЕЩИНСКАЯ

Казанский государственный университет

Посвящается светлой памяти

академика А.А. Баева

ВВЕДЕНИЕ

В 1972 году появилась первая публикация, в которой сообщалось о получении in vitro рекомбинантной ДНК, состоящей из фрагментов разных молекул ДНК: вирусной, бактериальной и фаговой. Работа была выполнена американским ученым Полом Бергом с сотрудниками и ознаменовала рождение новой отрасли молекулярной биологии W генетической (генной) инженерии.

А.А. Баев был первым в нашей стране ученым, который поверил в перспективность генной инженерии и возглавил исследования в этой области. Генетическая, или генная, инженерия, по его определению, W это конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или, иначе, W создание искусственных генетических программ. Генная инженерия имеет целью изучение интимных механизмов функционирования генетического аппарата эукариот, включая человека, что другими приемами сделать невозможно. Вместе с тем, генная инженерия ставит перед собой обширные практические задачи, немало из которых уже решено. Прежде всего это получение путем бактериального синтеза ряда лекарственных средств, например инсулина, интерферонов. Важнейшим достижением является создание диагностических препаратов, в частности, для выявления такого опасного заболевания, как СПИД. Получение так называемых трансгенных растений открывает принципиально новые возможности для растениеводства в создании сельскохозяйственных культур, устойчивых к экстремальным воздействиям и инфекционным поражениям. Это далеко не полный перечень практических свершений генной инженерии.

После первых успешных экспериментов с рекомбинацией молекул ДНК в пробирке появились первые сомнения и опасения, не принесет ли генная инженерия вред природе и человечеству. В июле 1974 года несколько крупных ученых обратились к научной общественности с предложением наложить мораторий на работы с рекомбинантными ДНК in vitro. В феврале 1975 года в Калифорнии на Асиломарской конференции собрались 140 ученых разных стран, работающих в области генной инженерии. Всесторонне изучив результаты и возможные последствия, ученые пришли к выводу, что потенциальные опасности невелики, так как рекомбинантные штаммы в природных условиях нежизнеспособны и их бесконтрольное распространение маловероятно. Было решено прервать мораторий и продолжить исследования с соблюдением специально разработанных правил. Сегодня мы можем отметить, что почти за четверть века своего существования генная инженерия не причинила никакого вреда самим исследователям, не принесла ущерба ни природе, ни человеку. Свершения генной инженерии как в познании механизмов функционирования организмов, так и в прикладном плане весьма внушительны, а перспективы поистине фантастичны.

В одной статье невозможно даже коротко изложить современное положение и перспективы генетической инженерии. Мы рассмотрим следующие, на наш взгляд, наиболее интересные вопросы.

1. Каковы теоретические основы генетической инженерии?

2. Чем генная инженерия принципиально отличается от классической селекции?

3. Как это делается?

4. Некоторые научные результаты.

5. Наиболее впечатляющие практические свершения.

КАКОВЫ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ?

Молекулярная биология заявила о себе в качестве самостоятельной науки в 1953 году, когда Джеймс Уотсон и Френсис Крик открыли знаменитую двойную спираль ДНК и постулировали матричный механизм ее синтеза.

В соответствии с этим механизмом двойная спираль ДНК при репликации разделяется и каждая цепь служит матрицей для синтеза дочерней цепи, которая по своей первичной структуре является зеркальным отражением матрицы. В результате такого матричного синтеза образуются две совершенно идентичные двуспиральные молекулы ДНК, каждая из которых передается в дочерние клетки. Последние получают всю генетическую программу от родительской клетки. По такому же матричному механизму осуществляется синтез РНК, только РНК синтезируется в виде односпиральной цепи, которая комплементарна ДНК-матрице. Этот процесс получил название транскрипции. А процесс синтеза белка на РНК-матрице (мРНК) происходит на рибосомах, и структура белка соответствует структуре мРНК. Это очень сложный процесс, он называется трансляцией, и в нем участвует транспортная РНК (тРНК). Она доставляет в рибосому аминокислоты и адаптирует язык мРНК к языку белка. Таким образом, процесс матричного синтеза ДНК определяет передачу наследственной информации от родительской клетки в дочернюю. В процессе матричного синтеза РНК происходит передача информации (генетического кода данного белка) от ДНК на мРНК, а мРНК переносит информацию на рибосому, где она реализуется в виде конкретной структуры белка.

При половом процессе может происходить обмен участками между двумя хромосомами (молекулами ДНК) от двух скрещиваемых индивидуумов. Этот процесс получил название рекомбинации, и в клетке чаще всего он может происходить только между гомологичными хромосомами, так как комплементарные по своей структуре молекулы ДНК притягиваются друг к другу и обмениваются генетическими детерминантами, в результате чего образуется дочерняя хромосома, содержащая элементы структуры от двух родительских хромосом. Открытый недавно процесс негомологичной рекомбинации осуществляется только в том случае, если в одной из взаимодействующих молекул ДНК есть гены, кодирующие специальные ферменты разрезания ДНК.

Следующее важное открытие, предопределившее возникновение генной инженерии, W обнаружение в бактериальных клетках внехромосомных маленьких кольцевых молекул ДНК. Эти минихромосомы впервые были обнаружены в начале 50-х годов и получили название плазмид. Плазмиды обладают способностью к автономной от хромосомы репликации, поэтому плазмиды содержатся в клетке в виде нескольких копий. Различаются плазмиды по генетическим детерминантам. Очень важно, что плазмиды из-за своих малых размеров могут быть выделены из клетки в неповрежденном, нативном состоянии.

В 1970 году американцы Келли и Смит с сотрудниками выделили первую рестриктазу W фермент, который вызывает гидролиз ДНК в строго определенных местах с образованием так называемых липких концов, о чем подробнее будет рассказано в третьем разделе. Существование таких ферментов-рестриктаз было доказано в опытах швейцарцев Линна и Арбера в конце 60-х годов. В настоящее время описано множество таких ферментов, которые применяются в генной инженерии.

Таким образом, к началу 70-х годов были сформулированы основные принципы функционирования нуклеиновых кислот и белков в живом организме и созданы теоретические предпосылки генной инженерии

ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Перенос генов животных.

Из генов животных первыми были введены в бактерию гены шпорцевой лягушки Xenopus laevis. Эти гены хорошо изучены и легко поддаются идентификации. Их ввели в клетки штамма E. coli, устойчивого к тетрациклину, и они здесь реплицировались. У полученных клонов состав ДНК соединял в себе характеристики X. laevis и E. coli.

В настоящее время научились уже переносить гены от одного животного к другому и от животного к растениям. Получены «трансгенные» мыши, свиньи, овцы, коровы и рыбы. ДНК можно прямо инъецировать в оплодотворенное яйцо вида-реципиента, или можно использовать в качестве переносчика вирус, который, проникнув в клетку, внесет с собой и нужный ген. Третий метод связан с использованием неспециализированных стволовых (т.е. родоначальных) клеток эмбриона. Гены вводят в стволовые клетки путем инъекции или с помощью вируса, и полученные в результате трансгенные клетки инъецируют другому зародышу, который включает эти чужие клетки в свои ткани. Гены человека вводили и в растения, например в табак, в надежде получить таким способом большие количества нужных белков, в частности антител и ферментов. В этих экспериментах перенос генов оказался довольно простым делом. Была придумана специальная «генная пушка», выстреливающая ДНК прямо в листья растений.

Практическое применение.

Теперь умеют уже синтезировать гены, и с помощью таких синтезированных генов, введенных в бактерии, получают ряд веществ, в частности гормоны и интерферон. Их производство составило важную отрасль биотехнологии.

Интерферон – белок, синтезируемый организмом в ответ на вирусную инфекцию, изучают сейчас как возможное средство лечения рака и СПИДа. Понадобились бы тысячи литров крови человека, чтобы получить такое количество интерферона, какое дает всего один литр бактериальной культуры. Ясно, что выигрыш от массового производства этого вещества очень велик. Очень важную роль играет также получаемый на основе микробиологического синтеза инсулин, необходимый для лечения диабета. Методами генной инженерии удалось создать и ряд вакцин, которые испытываются сейчас для проверки их эффективности против вызывающего СПИД вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). С помощью рекомбинантной ДНК получают в достаточных количествах и человеческий гормон роста, единственное средство лечения редкой детской болезни – гипофизарной карликовости.

Еще одно перспективное направление в медицине, связанное с рекомбинантной ДНК, – т.н. генная терапия. В этих работах, которые пока еще не вышли из экспериментальной стадии, в организм для борьбы с опухолью вводится сконструированная по методу генной инженерии копия гена, кодирующего мощный противоопухолевый фермент. Генную терапию начали применять также для борьбы с наследственными нарушениями в иммунной системе.

В сельском хозяйстве удалось генетически изменить десятки продовольственных и кормовых культур. В животноводстве использование гормона роста, полученного биотехнологическим путем, позволило повысить удои молока; с помощью генетически измененного вируса создана вакцина против герпеса у свиней.

Общественное мнение.

Несмотря на явную пользу от генетических исследований и экспериментов, само понятие «генная инженерия» породило различные подозрения и страхи, стало предметом озабоченности и даже политических споров. Многие опасаются, например, что какой-нибудь вирус, вызывающий рак у человека, будет введен в бактерию, обычно живущую в теле или на коже человека, и тогда эта бактерия будет вызывать рак. Возможно также, что плазмиду, несущую ген устойчивости к лекарственным препаратам, введут в пневмококк, в результате чего пневмококк станет устойчивым к антибиотикам и пневмония не будет поддаваться лечению. Такого рода опасности, несомненно, существуют.

Генетические исследования ведутся серьезными и ответственными учеными, а методы, позволяющие свести к минимуму возможность случайного распространения потенциально опасных микробов, все время совершенствуются. Оценивая возможные опасности, которые эти исследования в себе таят, следует сопоставлять их с подлинными трагедиями, вызванными недоеданием и болезнями, губящими и калечащими людей. См. также НАСЛЕДСТВЕННОСТЬ; НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ; МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ.

ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ, или технология рекомбинантных ДНК, изменение с помощью биохимических и генетических методик хромосомного материала – основного наследственного вещества клеток. Хромосомный материал состоит из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Биологи изолируют те или иные участки ДНК, соединяют их в новых комбинациях и переносят из одной клетки в другую. В результате удается осуществить такие изменения генома, которые естественным путем вряд ли могли бы возникнуть.

Методом генной инженерии получен уже ряд препаратов, в том числе инсулин человека и противовирусный препарат интерферон. И хотя эта технология еще только разрабатывается, она сулит достижение огромных успехов и в медицине, и в сельском хозяйстве. В медицине, например, это весьма перспективный путь создания и производства вакцин. В сельском хозяйстве с помощью рекомбинантной ДНК могут быть получены сорта культурных растений, устойчивые к засухе, холоду, болезням, насекомым-вредителям и гербицидам.

Перенос плазмид у бактерий.

Большая часть работ по переносу участков ДНК, или генов, проводилась до последнего времени на бактериях. У бактерий генетическая информация заключена в одной большой молекуле ДНК – хромосоме бактерии. Поскольку бактерии размножаются бесполым путем, эта генетическая информация на протяжении многих поколений остается в значительной степени неизменной. В бактериальной клетке имеются, помимо главной ее хромосомы, еще и небольшие кольцевые сегменты ДНК. Эти молекулы ДНК, т.н. плазмиды, часто несут в себе гены, ответственные за устойчивость к антибиотикам.

Плазмиды можно извлечь из одной клетки и перенести в другую. Такие работы проводятся, например, на Esсherichia coli (кишечной палочке), безвредной бактерии, обитающей в желудочно-кишечном тракте человека. Некоторые из клеток E. coli содержат плазмиду с генами устойчивости к антибиотику тетрациклину. Такие плазмиды – их называют факторами устойчивости – легко отделить от главной хромосомной ДНК. Неустойчивые к тетрациклину (разрушаемые им) бактерии можно заставить включить в себя эти плазмиды, подвергнув клетки соответствующей химической обработке, которая сделает оболочку проницаемой для чужих плазмид. Клетки, получившие таким способом фактор устойчивости, выживают на культуральной среде, содержащей тетрациклин, тогда как неустойчивые клетки погибают. Из каждой клетки – в результате многократных делений – возникает клон, т.е. собрание точных копий одной-единственной клетки, полученных путем бесполого размножения. Плазмида воспроизводится в каждой клетке клона, и ее воспроизведение называют молекулярным клонированием.

Соединение разных плазмид.

Плазмиды можно разрезать, фрагменты сращивать друг с другом, а затем такие комбинированные плазмиды вводить в клетки. Можно соединять фрагменты ДНК одного и того же вида или же разных видов.

Поскольку плазмидная ДНК представляет собой замкнутую кольцевую молекулу, кольцо нужно сперва разорвать таким образом, чтобы свободные концы были в химическом отношении реакционноспособными, пригодными для последующего соединения. Достичь этого удается либо простым механическим путем (например, сильным встряхиванием), либо с помощью различных ферментов, называемых нуклеазами (рестриктазами). Затем фрагменты ДНК соединяют с помощью лигаз – ферментов, исправляющих повреждения в ДНК и сшивающих концы ее разорванных нитей. Именно таким путем плазмиды из штамма E. coli, устойчивого к тетрациклину, и плазмиды из штамма, устойчивого к другому антибиотику, каномицину, можно соединить и получить штаммE. coli, устойчивый к обоим антибиотикам.

Эксперименты с двумя видами.

Плазмиды другого вида бактерий, например Staphylococcus aureus(золотистого стафилококка), сами по себе не способны размножаться в клетках E. coli. Однако в них могут размножаться гибридные плазмиды, составленные искусственным путем из куска плазмиды S. aureus и фрагмента плазмиды E. coli. Был проведен эксперимент, в котором соединили плазмиды S. aureus, устойчивого к пенициллину, и плазмиды штамма E. coli, устойчивого к тетрациклину. Когда затем гибридные плазмиды были введены в клетки E. coli, полученный штамм оказался устойчивым и к пенициллину, и к тетрациклину. Этот эксперимент, в котором был осуществлен перенос генетической информации между неродственными организмами, позволил предположить, что в клетки бактерии можно вводить молекулы ДНК и высших организмов и что они будут в этих клетках реплицироваться (копироваться)